一、產品描述

貨號： R170（部分代理商標注為78R170或R170-100）

英文名稱： Red Retrobeads™

中文名稱： 紅色逆行示蹤熒光微球

品牌： Lumafluor

規格： 100 μl/支

濃度： 約1×10? beads/ml

微球直徑： 10 μm ± 0.5 μm

熒光染料類型： 磺酰羅丹明B衍生物（Sulforhodamine B derivative），屬于羅丹明類紅色熒光染料

光譜特性： 最大激發波長約530 nm，最大發射波長約590 nm

包裝形式： 濃縮微球懸浮液，懸浮介質為蒸餾水，密封于避光小瓶中

產品類別： 神經元逆行示蹤劑（Retrograde Tracer）

產地： 美國

貨期：現貨

中國區供應商：上海起發實驗試劑有限公司 

產品定位： R170是Lumafluor公司RetroBeads™系列中的經典款紅色熒光逆行示蹤微球，是該系列中較早被廣泛使用、文獻引用量較大的基礎型號。與進階款R180（Red IX Retrobeads™）和旗艦款G180（Green IX Retrobeads™）共同構成Lumafluor的RetroBeads™產品矩陣。

二、產品特點

1. 高度局限的注射擴散特性

R170微球注射后在注射部位的擴散范圍通常小于1毫米，這一特性使其非常適合用于精細神經連接研究。注射位點高度集中，不易彌散到鄰近的非目標結構，從而顯著降低誤標風險，提高神經環路定位的精準度。

2. 信號強度高，單顆粒可見

每一個微球內部包裹了大量磺酰羅丹明B染料分子，單個微球在熒光顯微鏡下即可呈現明亮的紅色熒光信號。即使在低濃度條件下，也能保持較高的檢測靈敏度。

3. 體內長期穩定性

文獻報道和廠家實驗數據均表明，R170微球在活細胞或活體組織內可穩定存在超過14個月，熒光強度和標記質量在此期間未見明顯下降。部分研究推測其標記可能是接近長期性的。這一特性使其適用于需要長存活期的慢性實驗設計。

4. 生物相容性好，無明顯毒性

截至目前，未見R170微球對實驗動物或神經元產生毒性作用的報道。該產品支持在清醒動物上進行在體實驗，適合長期縱向研究。

5. 與多種實驗技術兼容

R170可與大多數順行示蹤劑聯合使用，實現多色或多方向神經環路示蹤。同時，它與原位雜交（in situ hybridization）、免疫組織化學（immunohistochemistry）等技術兼容，可在同一批切片上進行多重標記實驗。

6. 光譜獨立性

R170的紅色熒光通道（激發約530 nm / 發射約590 nm）與綠色熒光蛋白（GFP）、黃色熒光蛋白（YFP）等常用熒光標記無顯著光譜重疊，便于在同一樣本中實現多色熒光成像。

7. 文獻支撐充分

Lumafluor的RetroBeads™系列產品經數百篇已發表研究論文驗證，研究對象涵蓋從無脊椎動物到靈長類動物的廣泛物種體系，是逆行示蹤領域被文獻引用較多的熒光微球產品之一。

三、儲存條件

推薦儲存溫度： 4°C冷藏保存。

避光要求： 建議在避光或暗處保存，避免熒光染料因長期光照而淬滅。

防蒸發措施： 珠溶液應存放于密封良好的容器中，防止水分蒸發導致微球濃度改變或干涸。建議在冰箱內放置于加濕容器中進一步降低蒸發風險。

嚴禁冷凍： 絕對禁止將R170微球冷凍保存。冷凍會導致微球結構破壞、熒光淬滅，凍結后的產品無法恢復活性，不可繼續使用。

干燥后不可復溶： 若微球因密封不嚴等原因發生干燥，無法重新懸浮恢復，相應產品即告失效。

有效期： 在嚴格遵循上述儲存條件的前提下，R170可保持數年穩定。廠家未明確標注固定有效期，但建議在到貨后一年內使用完畢以獲得最佳實驗效果。

四、工作原理

R170 Red Retrobeads™的工作原理基于神經元末梢的胞吞作用（endocytosis）和軸突逆行轉運（retrograde axonal transport）機制。

第一步：末梢攝取

將R170微球懸浮液注射到目標腦區或神經核團后，微球被局限在注射位點附近（擴散范圍通常小于1毫米）。該區域的神經元軸突末梢通過胞吞作用將微球顆粒攝取進入細胞內。

第二步：逆行軸突運輸

攝取了微球的末梢啟動逆行轉運程序，微球沿軸突被運輸回神經元的胞體（soma）區域。這一過程依賴細胞內的微管馬達蛋白（主要為動力蛋白dynein）驅動。

第三步：胞體沉積與長期留存

微球到達胞體后沉積在細胞質中，形成明亮、穩定的紅色熒光標記。由于微球被包裹在聚苯乙烯聚合物殼體內，染料分子不會從微球中泄漏，也不會被細胞代謝降解，因此標記可在胞體內長期保留。

第四步：熒光檢測

在熒光顯微鏡下，使用羅丹明濾光片組（激發約530-550 nm，發射約570-600 nm）即可觀察到標記神經元的紅色熒光信號。每個被標記細胞的胞體內可見多個明亮的紅色熒光點。

這一機制使研究者能夠通過檢測遠端腦區中的熒光標記細胞，反推該腦區向注射位點投射的神經元的空間分布，從而繪制神經連接圖譜。

五、解決實驗中的哪些問題

1. 神經環路連接圖譜繪制

R170幫助研究者確定"哪些腦區的神經元向目標區域發送投射"，是解析大腦神經網絡拓撲結構的基礎工具。通過在不同腦區注射R170并檢測遠端標記細胞，可系統繪制腦區間的投射圖譜。

2. 注射位點的高精度定位需求

傳統示蹤劑（如熒光染料CTB、Fluoro-Gold等）在注射后容易沿針道或組織間隙擴散，導致標記范圍模糊。R170的微球物理形態使其注射后擴散極小，能夠精確定位到亞毫米級別的核團邊界，適合需要高空間分辨率的連接組學研究。

3. 長程投射的慢性追蹤

部分示蹤劑在體內的存留時間有限，不適合需要較長存活期的實驗。R170可在體內穩定存在超過一年，適用于需要數周甚至數月存活期的長程投射研究、神經發育追蹤、以及移植神經元的長期整合監測。

4. 多色組合示蹤

R170的紅色通道與GFP/YFP等綠色熒光標記互不干擾，可與綠色RetroBeads（G180）聯合使用，實現雙色逆行示蹤，分別標記兩個不同靶區的輸入神經元。

5. 與免疫組化/原位雜交的聯合檢測

R170標記不影響后續免疫組化染色或原位雜交實驗的操作流程，可在同一張切片上同時進行熒光微球逆行標記和特定蛋白/基因的表達檢測，實現"投射來源+分子身份"的雙重鑒定。

6. 大范圍核團標記

雖然單次注射擴散范圍小，但R170可通過多點位注射策略標記投射到較大核團的神經元群體，配合立體定位技術實現系統性覆蓋。

六、使用方法

第一步：實驗前準備

從4°C冰箱中取出R170小瓶，在室溫下靜置片刻使溶液溫度回升。輕柔搖勻或渦旋混勻微球懸浮液，確保微球均勻分布。不建議超聲處理，以免破壞微球結構。

第二步：稀釋（如需要）

對于初次實驗，強烈建議使用原液（不稀釋）進行注射，以確保單位體積內微球數量充足，獲得可靠的標記效果。在部分腦區（如大鼠視皮層）的實驗中，1:4稀釋未觀察到標記質量下降，但這一比例需根據具體實驗腦區和物種進行調整。可使用蒸餾水或常規鹽溶液（NaCl、KCl溶液）作為稀釋液。注意：綠色RetroBeads不建議稀釋，R170如需稀釋應做好預實驗驗證。

第三步：立體定位注射

將實驗動物麻醉后固定于立體定位儀上，按照目標腦區的標準立體定位坐標調整注射針位置。推薦使用壓力注射系統，如1 mL Hamilton微量注射器或氣動注射裝置。

注射量參考：局部微小區域注射可使用30-50 nL，注射針直徑約30-50 μm；常規逆行示蹤注射量為0.1-0.3 μL，可使用較大口徑的玻璃微量移液管。

注射速度應緩慢均勻，注射完畢后留針5-10分鐘再緩慢退針，以減少微球沿針道回流。

第四步：多點注射策略

由于R170在注射后擴散范圍小（<1 mm），對于較大的目標核團，需要進行多個位點的注射以充分覆蓋目標區域。注射位點數量和間距應根據核團大小和形態進行合理規劃。

第五步：術后存活

在大多數恒溫脊椎動物（小鼠、大鼠等）中，最短有效存活時間約為24小時。標記強度在48小時內隨存活時間增加而增強，48小時后趨于穩定。建議常規存活期為5-7天。對于遠距離投射或大型動物，可適當延長存活期。冷血動物建議存活期設為1周。

第六步：灌注固定

動物深度麻醉后，用0.1 M磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）進行心臟灌注沖洗血液，隨后用4%多聚甲醛（PFA，溶于0.1 M磷酸緩沖液，pH 7.4）灌注固定。灌注量一般為50-100 mL（小鼠）或200-300 mL（大鼠），具體根據動物體重調整。

重要提醒： 避免使用戊二醛（glutaraldehyde）作為固定劑。戊二醛會引起嚴重的組織自發熒光，顯著干擾微球熒光信號的檢測。在戊二醛固定的組織中，綠色微球可能全不可見。

第七步：后固定與切片

取腦后置于4% PFA中后固定2-4小時（小鼠）或過夜（大鼠），隨后轉入30%蔗糖溶液中進行冷凍保護，直至腦組織沉底。使用冰凍切片機將腦組織切成30-50 μm厚度的冠狀或矢狀切片。

第八步：貼片與封片

將切片用PBS漂洗后，貼附于明膠包被的載玻片上，室溫空氣干燥。全干燥后，用二甲苯透明1分鐘，隨后使用熒光封片劑（如Fluoromount或Krystalon）封片。

封片注意事項： 切片接觸乙醇或二甲苯的時間不宜過長，超過5分鐘可能損傷微球。嚴禁使用含甘油的封片劑，微球對甘油高度敏感，甘油會導致熒光快速淬滅。如無法避免使用甘油體系，可改用甲酯水楊酸（methyl salicylate）作為替代封閉介質。

七、熒光顯微鏡觀察建議

濾光片選擇： R170中的染料為羅丹明類，可使用任何標準羅丹明濾光片組進行觀察。有用戶反饋部分尼康老舊型號羅丹明濾光片背景較高，建議優先選用蔡司（Zeiss）或徠卡（Leica）的標準羅丹明濾光片組，可獲得較理想的信噪比。

物鏡選擇： 低倍干鏡（如4×、10×干鏡）通常難以清晰分辨單個標記細胞。推薦使用10×油鏡（數值孔徑NA ≥ 0.4）或更高倍率的油鏡進行觀察。25×油鏡可顯著提升綠色微球（以及紅色微球的細節）的成像清晰度。在判定實驗是否失敗之前，務必使用油鏡檢查注射位點附近的切片——該區域應存在大量局部標記細胞，可作為陽性對照參考。

光穩定性： R170在長時間連續觀察和顯微攝影過程中表現出良好的抗光漂白特性，熒光信號不易因光照而快速衰減。

八、常見問題與解決方案

問題一：注射后未觀察到標記細胞

可能原因包括：注射位點偏離目標核團、存活時間不足、微球濃度過低（如過度稀釋）、固定或切片過程中微球丟失。

解決方案：首先用油鏡檢查注射位點附近切片，確認是否存在局部標記細胞。若注射位點有標記但遠端無標記，需核實立體定位坐標是否準確、存活時間是否足夠（至少24小時，建議5-7天）。若注射位點也無標記，可能是微球失效或注射系統堵塞，建議檢查注射器通暢性并確認產品儲存條件是否合規。

問題二：標記信號弱

可能原因：微球稀釋比例過高、注射量不足、存活時間過短、物鏡倍率或濾光片不匹配。

解決方案：初次實驗使用原液而非稀釋液；適當增加注射量或在目標核團內增加注射位點數；確保存活期不少于5天；換用高數值孔徑油鏡并確認濾光片組匹配羅丹明光譜。

問題三：背景熒光高，信噪比差

可能原因：使用了戊二醛固定、組織自發熒光強、封片劑選擇不當、切片過厚。

解決方案：固定過程嚴格使用4% PFA，避免戊二醛；優先選用幼年動物（組織自發熒光較低）；使用薄切片（如30 μm而非40-50 μm）；封片后盡快觀察（背景熒光會隨時間增強）；選擇高信噪比的封片劑。

問題四：微球擴散到非目標區域，導致誤標

可能原因：注射量過大、注射速度過快、留針時間不足導致微球沿針道反流。

解決方案：降低單次注射體積，增加注射位點數量以實現均勻覆蓋；減慢注射速度；注射完畢后延長留針時間（10-15分鐘）再緩慢退針。

問題五：微球在儲存后出現沉淀或結塊

可能原因：儲存溫度不當（如冷凍）、密封不嚴導致蒸發干燥、長期靜置未混勻。

解決方案：R170必須4°C冷藏、密封、避光保存，嚴禁冷凍。每次使用前輕柔搖勻。若發現不可逆結塊或沉淀性狀明顯改變，建議聯系供應商確認是否仍可使用，必要時更換新產品。

問題六：與免疫組化聯用時信號互相干擾

可能原因：熒光二抗與R170紅色通道光譜重疊、抗體濃度過高導致背景升高。

解決方案：選擇熒光二抗時避開紅色通道（如選用488 nm綠色通道或647 nm遠紅色通道的二抗）；每批實驗設置陰性對照（未注射側組織或未注射動物）以評估背景水平；優化抗體稀釋比例。

問題七：無法用離子電滲法（iontophoresis）成功遞送微球

原因分析：雖然R170微球帶有凈負電荷，但離子電滲法并不是有效的遞送方式，微球粒徑較大，電滲效率很低。

解決方案：堅持使用壓力注射方式遞送R170，不嘗試離子電滲法。

九、注意事項與安全信息

本產品僅限科研用途，不可用于人體臨床診斷和治療。操作過程中建議佩戴手套和護目鏡，避免直接接觸皮膚或眼睛。廢棄微球溶液應按照實驗室生物廢棄物處理規范進行處置。使用過程中如不慎濺入眼睛，應立即用大量清水沖洗并就醫。

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（注：本文內容基于品牌公開資料及行業常規信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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