【產(chǎn)品描述】

貨號(hào)：G180

英文名稱：Green Retrobeads™ IX

中文名稱：綠色逆向示蹤熒光微粒（綠色逆行示蹤微球）

品牌：Lumafluor, Inc.（美國(guó)）

規(guī)格：100 µl（液體懸浮液，濃縮原液）

熒光顏色：綠色

激發(fā)波長(zhǎng)（Excitation）：約 480 nm

發(fā)射波長(zhǎng)（Emission）：約 520 nm

核心成分：聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸甲酯基微球，表面共價(jià)偶聯(lián)綠色熒光染料

溶劑體系：水性懸浮液，含表面活性劑以維持分散穩(wěn)定性

微球直徑：約 0.02–0.2 µm（典型值，具體以批次檢測(cè)報(bào)告為準(zhǔn)）

濃度：約 10% 固體含量（w/v），可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求稀釋

適用物種：大鼠、小鼠、非人靈長(zhǎng)類及其他哺乳動(dòng)物

應(yīng)用領(lǐng)域：神經(jīng)科學(xué)、神經(jīng)解剖學(xué)、神經(jīng)環(huán)路追蹤、腦圖譜繪制、神經(jīng)元連接組學(xué)、藥物遞送研究

儲(chǔ)存溫度：4°C 避光保存

有效期：自生產(chǎn)日期起 12 個(gè)月（具體以瓶身標(biāo)注為準(zhǔn)）

原產(chǎn)國(guó)：美國(guó)

運(yùn)輸條件：冷藏運(yùn)輸（4–8°C）

安全提示：僅供科研使用，非臨床用途；操作需佩戴防護(hù)手套與護(hù)目鏡

中國(guó)區(qū)域供應(yīng)商：上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司

【產(chǎn)品特點(diǎn)】

1. 高熒光強(qiáng)度與高信噪比

 微球內(nèi)部包埋高濃度綠色熒光染料，熒光信號(hào)強(qiáng)，背景自發(fā)熒光低，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮綠色熒光，便于低倍鏡掃描與高倍鏡精確定位。

2. 逆向（逆行）運(yùn)輸效率高

 微粒尺寸經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)，可被神經(jīng)末梢高效內(nèi)吞，并沿軸突逆向運(yùn)輸至胞體，實(shí)現(xiàn)"從靶區(qū)反推起源"的示蹤策略，標(biāo)記效率穩(wěn)定可靠。

3. 長(zhǎng)期體內(nèi)穩(wěn)定性

 熒光信號(hào)在固定組織中可保持?jǐn)?shù)月不褪，適合長(zhǎng)時(shí)程實(shí)驗(yàn)（數(shù)周至數(shù)月）。經(jīng)醛類固定后熒光保留良好，兼容石蠟包埋與冰凍切片。

4. 低擴(kuò)散、低泄漏

 微球被神經(jīng)元內(nèi)吞后不易逸出細(xì)胞膜，注射位點(diǎn)周圍擴(kuò)散范圍小，標(biāo)記邊界清晰，可有效減少"假陽(yáng)性"誤判。

5. 與紅色示蹤劑高度互補(bǔ)

 綠色熒光通道（FITC/GFP 通道）與 Lumafluor 紅色示蹤微球（如 Red Retrobeads™ IX）光譜無(wú)重疊，可在同一組織中實(shí)現(xiàn)  雙色或多色逆向示蹤實(shí)驗(yàn)。

6. 即用型制劑

 產(chǎn)品為即用型液體懸浮液，無(wú)需溶解、復(fù)溶或復(fù)雜前處理，開(kāi)瓶后  短暫渦旋混勻即可上樣，節(jié)省實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備時(shí)間。

7. 表面化學(xué)性質(zhì)可控

 微球表面經(jīng)過(guò)修飾處理，具有適度的親水性與表面電荷，既保證注射順暢不易堵塞針頭，又促進(jìn)神經(jīng)末梢的有效攝取。

【儲(chǔ)存條件】

1. 推薦儲(chǔ)存溫度：4°C ± 2°C（標(biāo)準(zhǔn)冰箱冷藏室）

2. 避光保存：建議使用鋁箔包裹瓶身或存放于不透光容器中，避免熒光染料因光照而光漂白

3. 嚴(yán)禁冷凍：冷凍會(huì)導(dǎo)致微球聚集、破裂或熒光淬滅， 解凍后可能出現(xiàn)不可逆的沉淀

4. 防止干燥：使用后務(wù)必?cái)Q緊瓶蓋，避免溶劑蒸發(fā)導(dǎo)致濃度改變或微球干結(jié)

5. 潔凈操作：每次取用前短暫渦旋（5–10 秒）混勻懸浮液；建議使用無(wú)菌槍頭，避免交叉污染

6. 有效期：開(kāi)封后建議在 6 個(gè)月內(nèi)使用完畢；未開(kāi)封狀態(tài)下按標(biāo)注有效期執(zhí)行

【工作原理】

G180 的工作原理基于"逆向軸突運(yùn)輸"（Retrograde Axonal Transport）機(jī)制：

第一步 — 注射與沉積

將 G180 懸浮液注射至目標(biāo)腦區(qū)或外周神經(jīng)靶區(qū)。微球以高濃度懸浮狀態(tài)沉積在注射位點(diǎn)周圍的組織間隙中。

第二步 — 神經(jīng)末梢攝取

沉積在靶區(qū)的微球被該區(qū)域神經(jīng)末梢通過(guò)胞吞作用（endocytosis）主動(dòng)攝取。微球尺寸經(jīng)過(guò)優(yōu)化，既足夠小以進(jìn)入內(nèi)吞途徑，又足夠大以避免快速被胞吐排出。

第三步 — 逆向運(yùn)輸至胞體

被攝取的微球包裹于內(nèi)體/溶酶體囊泡中，借助微管馬達(dá)蛋白（dynein 復(fù)合物）沿軸突以逆向方向運(yùn)輸，最終抵達(dá)神經(jīng)元的胞體（soma），在細(xì)胞核周圍富集。

第四步 — 熒光檢測(cè)

攜帶綠色熒光微球的神經(jīng)元胞體在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮綠色熒光。由于微球不透過(guò)細(xì)胞膜，信號(hào)被"鎖定"在陽(yáng)性神經(jīng)元內(nèi)部，背景干凈。

研究者可據(jù)此：

· 確定支配該靶區(qū)的所有上游神經(jīng)元群體

· 繪制腦區(qū)之間的連接圖譜

· 結(jié)合其他示蹤劑進(jìn)行多色環(huán)路分析

第五步 — 長(zhǎng)期保留

微球在神經(jīng)元胞體內(nèi)可長(zhǎng)期駐留（數(shù)周至數(shù)月），熒光信號(hào)衰減緩慢，適合長(zhǎng)時(shí)程追蹤實(shí)驗(yàn)。固定后熒光保留良好，可存檔反復(fù)觀察。

【解決的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題】

問(wèn)題一：傳統(tǒng)順行示蹤劑標(biāo)記方向單一

許多經(jīng)典示蹤劑（如 PHA-L、BDA）主要實(shí)現(xiàn)順行標(biāo)記，難以回答"哪些腦區(qū)投射到此處"的問(wèn)題。G180 提供逆向視角的補(bǔ)充方案。

問(wèn)題二：病毒示蹤劑耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜

病毒載體（如 rabies、HSV）需要數(shù)天至數(shù)周的擴(kuò)增表達(dá)周期，且涉及生物安全等級(jí)要求。G180 注射后數(shù)天即可檢測(cè)，無(wú)需病毒操作設(shè)施。

問(wèn)題三：熒光染料擴(kuò)散范圍大、定位不準(zhǔn)

游離熒光染料（如 Fluoro-Gold、DAPI 等）注射后易沿針道或組織間隙擴(kuò)散，標(biāo)記邊界模糊。G180 微球顆粒大、擴(kuò)散受限，注射位點(diǎn)緊湊，標(biāo)記精度更高。

問(wèn)題四：信號(hào)持續(xù)時(shí)間不足

部分染料在固定或包埋過(guò)程中熒光嚴(yán)重衰減。G180 微球熒光穩(wěn)定，兼容甲醛/多聚甲醛固定、蔗糖沉糖、OCT 包埋、冰凍切片及后續(xù)免疫組化染色。

問(wèn)題五：多色示蹤光譜串?dāng)_

在雙色或多色實(shí)驗(yàn)中，不同示蹤劑的光譜重疊會(huì)導(dǎo)致通道串?dāng)_。G180 的綠色熒光與紅色 Retrobeads 光譜分離良好，可在同一張切片上清晰區(qū)分兩種標(biāo)記群體。

問(wèn)題六：注射操作不便

部分示蹤劑為干粉形式，需自行配制且濃度難以控制。G180 為即用型液體，濃度均一，注射體積可控，重復(fù)性好。

【使用方法】

以下為典型的大鼠腦內(nèi)注射操作流程，研究者可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行調(diào)整。

步驟一：準(zhǔn)備工作

· 從 4°C 冰箱取出 G180，室溫平衡 10–15 分鐘

· 渦旋混勻 10 秒，確保微球均勻懸浮

· 如需要稀釋，使用提供的稀釋液或 0.01 M PBS（pH 7.4）

· 準(zhǔn)備立體定位儀、微量注射器（建議 1–10 µl 規(guī)格）、 30–33 G 注射針頭

步驟二：動(dòng)物麻醉與固定

· 按機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案實(shí)施麻醉

· 將動(dòng)物固定于立體定位儀，保持頭部穩(wěn)定

· 常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域

步驟三：開(kāi)顱/暴露注射靶點(diǎn)

· 沿中線切開(kāi)頭皮，剝離骨膜

· 使用顱骨鉆在目標(biāo)坐標(biāo)處開(kāi)一小孔（直徑約 1–2 mm）

· 避免損傷硬腦膜及大腦皮層表面血管

步驟四：裝載示蹤劑

· 用微量注射器吸取適量 G180 懸浮液

· 排出氣泡，確認(rèn)針尖有液體流出

· 記錄裝載體積

步驟五：緩慢注射

· 將針頭緩慢下降至目標(biāo)深度（典型速度 0.5–1 mm/min）

· 到達(dá)靶點(diǎn)后，以緩慢恒速注射（典型速率 0.1–0.5 µl/min）

· 大鼠常用注射體積：0.2–1.0 µl/位點(diǎn)

· 小鼠常用注射體積：0.05–0.3 µl/位點(diǎn)

· 注射完畢后留針 5–10 分鐘，以減少回流

步驟六：拔針與縫合

· 以緩慢速度（約 1 mm/min）拔出針頭

· 縫合頭皮切口，消毒傷口

· 將動(dòng)物置于溫暖環(huán)境中蘇醒

步驟七：存活期

· 典型存活時(shí)間：注射后 3–14 天（依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?/span>

· 較短存活期（3–5 天）適合快速運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)

· 較長(zhǎng)存活期（7–14 天）適合長(zhǎng)距離逆向運(yùn)輸或稀疏投射研究

· 期間正常飼養(yǎng)，觀察動(dòng)物狀態(tài)

步驟八：灌注固定與切片

· 深度麻醉動(dòng)物，經(jīng)心臟灌注生理鹽水沖洗血液

· 灌注 4% 多聚甲醛（PFA）固定組織

· 取腦，后置固定于 4% PFA 中 4–24 小時(shí)

· 轉(zhuǎn)移至 20%–30% 蔗糖溶液沉糖至組織沉底

· 冰凍切片（典型厚度 30–50 µm），貼片于載玻片

步驟九：封片與觀察

· 使用含 DAPI 的熒光封片劑封片（便于復(fù)染細(xì)胞核）

· 蓋玻片封固，指甲油封邊

· 熒光顯微鏡下使用 FITC/GFP 濾光片組觀察綠色熒光

· 激發(fā)光 480 nm，發(fā)射光 520 nm

· 拍照記錄，注意控制曝光時(shí)間以避免光漂白

【常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案】

問(wèn)題一：熒光信號(hào)弱或檢測(cè)不到

· 可能原因：注射體積不足、存活時(shí)間過(guò)短、注射位點(diǎn)偏離目標(biāo)、 微球未充分混勻、顯微鏡濾光片不匹配

· 解決方案：增加注射體積至推薦范圍上限；延長(zhǎng)存活期至 7 天以上；確認(rèn)立體定位坐標(biāo)準(zhǔn)確性；注射前充分渦旋；確認(rèn)使用FITC/GFP 通道觀察

問(wèn)題二：背景自發(fā)熒光高

· 可能原因：醛類固定劑（特別是戊二醛）產(chǎn)生組織自發(fā)熒光、封片劑含熒光雜質(zhì)、切片過(guò)厚

· 解決方案：使用低自發(fā)熒光的封片劑；如必須含醛固定，可嘗試處理切片以降低醛類自發(fā)熒光；控制切片厚度在30–40 µm

問(wèn)題三：注射位點(diǎn)擴(kuò)散范圍過(guò)大

· 可能原因：注射速度過(guò)快、注射體積過(guò)大、針頭口徑過(guò)粗、留針時(shí)間不足

· 解決方案：降低注射速率至 0.1 µl/min 以下；減少注射體積；使用更細(xì)的針頭（32–33 G）；延長(zhǎng)留針時(shí)間至 10 分鐘

問(wèn)題四：熒光信號(hào)快速淬滅

· 可能原因：觀察時(shí)激發(fā)光過(guò)強(qiáng)、暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、未使用抗淬滅封片劑

· 解決方案：使用抗熒光淬滅封片劑（如含 DABCO 或ProLong Gold 的產(chǎn)品）；降低激發(fā)光強(qiáng)度；縮短單次曝光時(shí)間；盡快拍照存檔

問(wèn)題五：微球堵塞針頭

· 可能原因：微球濃度過(guò)高、針頭過(guò)細(xì)、懸浮液靜置過(guò)久產(chǎn)生沉降

· 解決方案：注射前充分渦旋并間歇振蕩；可使用適當(dāng)稀釋的懸浮液；避免靜置超過(guò) 30 分鐘；必要時(shí)更換更大口徑針頭

問(wèn)題六：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少

· 可能原因：靶區(qū)神經(jīng)末梢密度低、投射通路稀疏、運(yùn)輸距離過(guò)長(zhǎng)、動(dòng)物品系差異

· 解決方案：增加注射位點(diǎn)數(shù)量（多點(diǎn)注射）；延長(zhǎng)存活期；適當(dāng)增大注射體積；參考同類文獻(xiàn)確認(rèn)預(yù)期標(biāo)記強(qiáng)度

問(wèn)題七：免疫組化染色效果不佳

· 可能原因：固定過(guò)度導(dǎo)致抗原表位遮蔽、抗體濃度不當(dāng)、通透步驟不充分

· 解決方案：控制固定時(shí)間在 4–24 小時(shí)內(nèi)；優(yōu)化抗體滴定；使用 0.3% Triton X-100 通透 30 分鐘；進(jìn)行抗原修復(fù) 處理

問(wèn)題八：與其他熒光標(biāo)記串?dāng)_

· 可能原因：濾光片帶寬過(guò)寬、多色標(biāo)記光譜重疊

· 解決方案：使用窄帶濾光片；合理安排多色實(shí)驗(yàn)的通道分配；采集時(shí)分離通道逐一拍照后合成

【注意事項(xiàng)】

1. 本產(chǎn)品僅供科研使用（For Research Use Only），不得用于臨床診斷或治療

2. 操作時(shí)請(qǐng)佩戴防護(hù)手套、護(hù)目鏡及實(shí)驗(yàn)服

3. 避免吸入氣溶膠或接觸皮膚、黏膜

4. 如懸浮液不慎接觸皮膚，立即用大量清水沖洗

5. 嚴(yán)禁冷凍保存，冷凍會(huì)導(dǎo)致微球不可逆聚集

6. 每次取用前務(wù)必渦旋混勻，確保微球均勻分散

7. 建議使用低自發(fā)熒光的試劑和耗材，以降低背景干擾

8. 熒光觀察時(shí)盡量縮短曝光時(shí)間，延長(zhǎng)樣本可觀察壽命

9. 不同批次間熒光強(qiáng)度可能存在微小差異，建議同一實(shí)驗(yàn)組使用同一批次產(chǎn)品

10. 廢棄樣本及耗材請(qǐng)按照實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物處理規(guī)范處置

【參考文獻(xiàn)】

1. Katz LC, Iarovici DM. Green fluorescent latex microspheres:  a new retrograde tracer. Neuroscience. 1990;34(2):511-520.

2. Lanciego JL, Wouterlood FG. A half century of tracing neuronal connections with horseradish peroxidase and fluorescent substances. J Chem Neuroanat. 2011;42(4):157-161.

3. Schmued LC, Fallon JH. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Res. 1986;377(1):147-154.

4. Wessendorf MW. Fluoro-Gold: composition, stability and suitability for retrograde labeling. J Neurosci Methods. 1991;38(1-2):1-17.

5. Veenman CL, Reiner A, Honig MG. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 1992;41(3):239-254.

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