celltechnology MITCAP說明書

MitoCasp

同時雙參數(shù)測定：線粒體膜電位檢測和半胱天冬酶（poly，3 / 7,8,9,1）活性。

產(chǎn)品代碼：MITCAP

產(chǎn)品描述

主要優(yōu)點

• 同時檢測線粒體膜電位和半胱天冬酶活性。
• 讀數(shù) - 流式細胞儀，熒光板讀數(shù)器，熒光顯微鏡。
• 可靠：產(chǎn)生定量和定性結(jié)果。給出了強烈的積極信號。
• 該試劑盒可與其他抗體或染色劑一起使用。
• 易于使用：無需制備細胞裂解液或進行蛋白質(zhì)印跡。
• 細胞滲透性試劑。

背景

半胱氨酸蛋白酶檢測

細胞凋亡是細胞自我殺的進化保守形式，其遵循專門的細胞過程。該過程的核心組成部分是一系列稱為半胱天冬酶的蛋白水解酶。這些酶參與一系列反應(yīng)，這些反應(yīng)是響應(yīng)促細胞凋亡信號而觸發(fā)的，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)底物的裂解，導(dǎo)致細胞的解體（1）。

已經(jīng)在從秀麗隱桿線蟲到人類的生物體中鑒定了半胱天冬酶。哺乳動物半胱天冬酶在細胞凋亡和炎癥中發(fā)揮不同的作用。在細胞凋亡中，半胱天冬酶負責導(dǎo)致細胞解體的蛋白水解切割（效應(yīng)caspase），并參與上游調(diào)節(jié)事件（啟動子半胱天冬酶）。活性半胱天冬酶由兩個大的（~20kD）和兩個小的（~10kD）亞單元組成，形成兩個異二聚體，它們以四聚體（2-4）結(jié)合。與其他蛋白酶一樣，半胱天冬酶被合成為經(jīng)歷蛋白水解成熟的前體，自催化或通過具有相似特異性的酶級聯(lián)進行（5）。

線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位的喪失是細胞凋亡的標志。線粒體通透性轉(zhuǎn)換是誘導(dǎo)細胞凋亡的重要步驟。在此過程中，線粒體膜上的電化學梯度崩潰。認為崩潰是通過二聚化的Bax或活化的Bid，Bak或Bad蛋白在線粒體中形成孔而發(fā)生的。這些促凋亡蛋白的活化伴隨著細胞色素c釋放到細胞質(zhì)中（11-14）。

分析原則

Caspase（poly，3 / 7,8,9,1）和線粒體膜電位檢測 - MitoCasp

半胱天冬酶特異性識別4個氨基酸序列（在其底物上），其必然包括天冬氨酸殘基。該殘基是裂解反應(yīng)的目標，其發(fā)生在天冬氨酸殘基的羰基末端（6）。可以通過免疫沉淀，使用半胱天冬酶特異性抗體的免疫印跡技術(shù)，或通過使用在半胱天冬酶切割后變?yōu)闊晒獾臒晒獾孜飦頇z測半胱天冬酶。MitoCasp使用一種新方法來檢測活性caspase（7-9）。該方法基于羧基熒光素（FAM）標記的氟甲基酮（FMK） - 半胱天冬酶的肽抑制劑。這些抑制劑具有細胞滲透性和非細胞毒性。一旦進入細胞內(nèi)，抑制劑就與活性半胱天冬酶（10）共價結(jié)合。

Cell Technology利用陽離子染料顯示線粒體膜電位（15-17）。陽離子染料是可透過細胞的，并且在紅色區(qū)域具有強熒光信號，并且表現(xiàn)出低的膜電位獨立（非特異性）結(jié)合和毒性。在健康細胞中，陽離子染料由線粒體與DeltaPsi（膜電位）成比例地累積。在大多數(shù)細胞系中，陽離子染料在線粒體中的積累導(dǎo)致更高的熒光強度。在凋亡細胞中，線粒體膜電位受損，陽離子染料不會在線粒體中積累，并且這些細胞表現(xiàn)出較低的熒光信號。結(jié)合使用這兩種試劑，可以同時分析Caspase活性和線粒體膜電位。

用Staurosporine刺激Jurkat細胞3小時（B）或DMSO（A）。然后根據(jù)方案用MitoCasp試劑盒染色細胞。然后將細胞洗滌兩次并通過流式細胞術(shù)分析：Ex：488nm Em：FL1和FL2。

套件內(nèi)容和長期存儲